X-Gal与X-α-gal可以互相替换吗?

2021-3-25 10:38:06
X-Gal与X-α-gal可以互相替换吗?X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶(LacZ)的反应底物,而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶(MEL1)的反应底物。X-α-gal用作酵母双杂交系统中蓝白筛选的筛选标记。二者不可以互相替换。

X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活。MEL1是GAL4酵母双杂交系统的一个报告基因,编码分泌型的α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色产物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色,即阳性的双杂交作用。X-α-Gal可在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用,利用此底物可以省去双杂交体系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays;

X-Gal用于检测β-半乳糖苷酶(LacZ)的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌,需裂解酵母细胞后通过加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays才能进行显色。因此操作流程相对繁琐。

携带MEL1基因的酵母菌株:Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A

1. X-α-gal 使用方法

一、涂布于预制平板:

1)溶解24 mg X-α-gal于6 mL DMF,终浓度为4 mg/ mL。

2)涂布200 μL(15 cm) 或者100 μL(10 cm)X-α-gal 储存液于预制平板上;

3)置于37℃培养箱至液体被吸收(由于DMF挥发性低,最长可放4小时);

4) 将转化细菌或酵母涂于平板上,于37℃或30℃培养直至蓝色菌落出现。

二、直接加入琼脂中:

1)溶解60 mg X-α-gal于3 mL DMF,终浓度为20 mg/ mL。

2)将已灭菌琼脂培养基冷却至50-55 ℃;

3)向上述培养基中加入20 mg/ mL X-α-Gal,比例为每升培养基中加入1 mL X-α-Gal溶液。

2. X-gal使用方法(filter-lift assays)

试剂准备
  • Z buffer

        16.1 g/L      Na2HPO4 · 7H2O  

         5.50 g/L      NaH2PO4· H2O     

         0.75 g/L      KCl                        

         0.246 g/L    MgSO4· 7H2O       

       调节pH 7.0,高温高压灭菌。可室温保存。

20 mg/mL X-gal 储液(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside),溶于DMF,保存于-20。
 
  • Z缓冲液/X-gal 溶液

         100 mL       Z buffer

         1.67 mL     X-gal 储液

         0.27 mL      β-mercaptoethanol

实验流程

1. 生长2-4天的新鲜单菌落; 用铅笔在滤纸上 画 8×8 的方格,每个方格放置一个新鲜培养的单菌落并记录下编号;

2. 配制 Z buffer/X-gal 反应液;

3. 在干净平皿中铺一张滤纸,用 Z buffer/X-gal 反应液(2.5-5 mL)将滤纸浸湿;

4. 用镊子另取一张无菌、干燥的滤纸,铺在划线培养的酵母菌表面,用镊子轻轻滚压,使菌转移到滤纸表面(注:在滤纸上做好方位标记,以便识别菌种编号);

5. 当滤纸全部湿润,用镊子将铺有菌落的滤纸放入液氮中速冻 30 sec,液氮需没过菌落;

6. 取出滤纸,放置于一干净平皿中使其室温解冻;

7. 用镊子将解冻的滤纸轻轻叠放在浸有反应液的滤纸上(有菌的表面朝上),保证两层滤纸间没有气泡;30°C,培养8 h,观察X-gal染色情况。菌落变 为蓝色的为阳性,超过 8 h 变蓝,很有能是假阳性。

注意事项:

1. x-gal注意遮光保存。

2. 液氮冰冻菌的时候可以试试反复冻融,这样会使细胞破碎的更加完全一些,便于染色液的渗透。
已经到最底了