​MTT实验步骤有哪些,有什么注意事项


MTT通常用于药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定以及细胞增殖及细胞活性测定。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。但是由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。在MTT实验步骤中要注意的是MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
 
MTT实验步骤——贴壁细胞(http://www.hnhbsj.com
1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2.、5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况
3.、5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5、终止培养,小心吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速震荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
 
MTT实验步骤——悬浮细胞http://www.hnhbsj.com
1、收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 lg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100(储存液100 1640)。
2、置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)
4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速震荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
在MTT实验步骤中需要注意的是MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。

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